生物與物理化學的結合：矽奈米線場效應電晶體偵測蛋白質間交互作用臺大跨領域研究團隊研究成果刊登本期美國國家科學院院刊

奈米科技與生物的結合，可激發出許多新的構想與突破。化學系陳逸聰教授（亦為中研院原分所合聘研究員）與動物學研究所潘建源副教授所帶領的研究團隊，經過多年的合作與努力，終於成功地將矽奈米線場效應電晶體（silicon nanowire field-effect transistor，簡稱SiNW-FET，如圖一與圖二所示）技術，應用於偵測蛋白質間的交互作用。在這個跨領域合作的過程中，為達成此研究目標，設計出各種實驗方式，也發表多篇重要的論文。最近的成果則是Label-free detection of protein-protein interactions using a calmodulin-modified nanowire transistor，已刊登於今年1月19日之Proceedings of the National Academy of Sciences USA（美國國家科學院院刊，簡稱PNAS），第107期，自1047至1052頁。

生命的種種活動，都需要透過蛋白質間的交互作用來進行。因此研究蛋白質間是否會有交互作用，對瞭解細胞的各項生理活動，是非常重要的。生命科學的許多研究，都是以蛋白質間如何作用為基礎，從而發展出各種技術，以驗證是否有交互作用的存在。常用的方法如免疫沉澱，其基本原理是 – 如果兩個蛋白質間有交互作用，那麼以抗體將其中一個蛋白質沉澱下來，另一個蛋白質也會因為有交互作用，而跟著一起被沉澱。然而，許多類似的實驗，多半需要有專一性很好的抗體，以及大量的蛋白質需求，並且工作時間得耗費數日才能完成。對許多研究而言，委實並非最佳的方式。

陳教授的研究團隊，於過去數年來積極對SiNW-FET的基本原理及其可能應用做深入的探討。具有半導體特性的矽奈米線，因擁有極高的表面積/體積比，故對表面週遭環境的變化非常敏感。若有分子接觸到SiNW-FET的表面，則將影響矽奈米線的表面電位，導致SiNW-FET改變其導電度。在應用SiNW-FET做為生物感測器時，因生化分子或生物細胞一般處於溶液態，實驗中必需顧及SiNW-FET與溶液界面的複雜電化學。然而經由縝密的設計，SiNW-FET已可做為檢測化學分子或生物系統的感測器，其優點不僅是擁有高靈敏度外，亦兼具專一選擇性，即時回應，無標記檢測，極少量樣品需求，與快速篩選的優異功能。

潘副教授的實驗室，主要是以電生理的方法探討神經細胞間的訊息傳導。同時也研究一類可與鈣離子結合的蛋白質，視其如何影響不同類型的鈣離子通道（calcium ion channel）活性。雖然發現有些鈣離子結合蛋白，可以調控鈣離子通道的電流特性，然而此蛋白質與鈣離子通道之間，並沒有明確的證據，可證明彼此間有直接的交互作用。因此在與陳教授討論後，雖然瞭解蛋白質間的交互作用，比起一般抗體與抗原的作用力要小得很多，利用SiNW-FET來偵測蛋白質間的交互作用，將是實驗上的一項挑戰。但經過詳細評估後，認為仍可應用SiNW-FET來與予探討。

陳、潘兩位教授的研究團隊，先前曾合作使用碳奈米管場效應電晶體（carbon nanotube field-effect transistor，簡稱CNT-FET）或SiNW-FET來檢測抗原與抗體的結合。在這類實驗中，是先在碳奈米管或矽奈米線上做表面化學修飾，將抗體連結在碳奈米管或矽奈米線上。而當抗原與抗體結合時，由於電場與電位的變化，可靈敏地在CNT-FET或SiNW-FET上產生電訊號。因此可以透過對CNT-FET或SiNW-FET的電導量測，瞭解抗原是否與抗體結合。在過去的實驗中，這團隊已成功地利用CNT-FET或SiNW-FET的系統，檢測出溶液中的微量 (100 pM) 抗原，並且可偵測到由單一細胞所釋放出的抗原蛋白。由於這種方法有很好的偵測靈敏度，且所需抗體及抗原的樣品量非常少，是一項深具潛力並可發展成為廣泛被應用的晶片檢驗技術。

然而在此系統的發展中，也因抗體-抗原的結合力太强，導致無法重複使用同一晶片，造成浪費與不便；同時也因無法重複使用晶片，致使要進行定量的測量，變得十分因難。為解決此一問題，在經過一連串的腦力激盪後，研究團隊決定利用穀胱甘肽（glutathione，簡稱GSH) 與穀胱甘肽轉移酶（glutathione S-transferase，簡稱GST）蛋白的可逆性結合特性，（如圖三所示）將GSH先修飾到SiNW-FET上，與GST融合之特定蛋白隨後便可藉由GST與SiNW-FET上之GSH結合。利用此修飾在SiNW-FET的特定蛋白，便可快速地篩檢可能與之反應的作用蛋白。這樣的裝置設計，不僅仍可維持很高的靈敏度，且每次實驗後，可用含高濃度GSH的清洗液，將SiNW-FET上之已使用過的特定蛋白清洗下來。整個晶片裝置便可重新使用，再次與新的GST融合蛋白結合，以進行下回的實驗。在這樣的設計下，因留在SiNW-FET表面上之GSH數目始終維持不變，用SiNW-FET進行的量度便可校準，以達到定量測量的目的。

在刊登於PNAS的這篇文章中，兩位教授的研究團隊將一個重要的鈣離子結合蛋白：鈣調素（calmodulin，簡稱CaM），與GST結合成融合蛋白 (簡稱CaM-GST)。實驗結果顯示，CaM與心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin I）結合時，至少需1 μM的鈣離子來活化其交互作用。而為瞭解CaM是否與鈣離子通道有直接的交互作用？因此從實驗上設計（如圖四所示），先將鈣離子通道表現在細胞膜上，再將細胞膜純化出來，然後將含鈣離子通道的細胞膜萃取物流進修飾有CaM的SiNW-FET上，由觀測電導變化以直接證明CaM與鈣離子通道的交互作用。這些正面的實驗結果讓整個團隊非常興奮，因為利用這樣的實驗模式，只要非常少量的蛋白，便可驗證蛋白質間是否有交互作用存在；而且所需的時間，比傳統的免疫沉澱縮短許多。

在將來，陳教授與潘教授的研究團隊（圖五與圖六），將進一步利用這些奈米技術與裝置，進行更多生化活性的測量，並應用於高通量篩選的檢測上。也歡迎有興趣的研究團隊，一起加入探討此類奈米科技的各種研發與應用。

圖一：以原子力顯微鏡掃描所得之矽奈米線場效應電晶體（SiNW-FET）的表面影像。左圖為SiNW-FET元件之俯視圖，顯示一矽奈米線橫跨在相距約2 μm的兩個電極間，右圖是同一SiNW-FET元件之3D圖像。

圖二：以SiNW-FET進行量測之實驗裝置圖。（a）製備有SiNW-FET陣列之晶片（1.5×1.5 c㎡）藉由鋁線（~30 μm直徑）與塑膠電路板連接。（b）聚雙甲基矽氧烷（poly-dimethylsiloxane，簡稱PDMS）材料做成之微流通道。（c）以壓克力板與螺絲將PDMS微流通道輕壓， 使之與SiNW-FET陣列晶片密合，液態之生化樣品則藉由針筒式幫浦抽取，並以塑膠管連接流進SiNW-FET陣列晶片上。（d）聯結SiNW-FET陣列電路及電訊號偵測系統。（e）電訊號偵測系統之儀器裝置圖。由左至右為鎖相放大器，電流放大器，電腦螢幕；螢幕上所顯示者即為測量所得的電訊號變化。

圖三：可重複使用之SiNW-FET元件示意圖。首先將GSH修飾到SiNW-FET上，與GST融合之CaM（簡稱CaM-GST）隨後便可藉由GST與SiNW-FET上之GSH結合。利用此修飾在SiNW-FET的CaM，便可快速地篩檢可能與CaM作用的蛋白。在實驗完成後，可用含高濃度GSH（1 mM）的清洗液，將已使用過的CaM-GST清洗下來，整個晶片裝置便可重新再使用，進行另次的實驗。

圖四：利用SiNW-FET驗證CaM與鈣離子通道之直接交互作用。（a）示意圖說明：先將鈣離子通道表現在細胞膜上，再將細胞膜純化出來；將細胞膜萃取液稀釋後，再經由PDMS微流通道流進修飾有CaM的SiNW-FET上，以量測電流的變化。（b–c）由於實驗所使用之SiNW摻雜有硼原子，所以SiNW-FET是為p-型半導體元件。當在pH = 7.4的實驗環境中，帶正電之鈣離子通道（等電量點，pI = 8.79）的IQ區與CaM結合時，不論Ca2+存在與否，均導致SiNW-FET之電流下降。（d）對照組實驗。上圖為當α1b的部分不存在於鈣離子通道時，顯示CaM與鈣離子通道並無交互作用。下圖為當CaM未修飾在SiNW-FET表面時，即使流進鈣離子通道，也未造成SiNW-FET之電流變化，這結果亦明確指出鈣離子通道與CaM之間的專一交互作用。